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2022 March Vol.35 No.1 ISSN 1598-8384

자유기고

Botulinum neurotoxin engineering 동향

Boston Children’s Hospital/Harvard Medical School
이평강 박사E-mail : Pyung-Gang.Lee@childrens.harvard.edu



보툴리늄 신경독소 (Botulinum neurotoxin)

보툴리늄 신경독소는 토양 미생물인 Clostridium botulinum 이 생산하는 독소 단백질로서 동물의 신경계를 표적하고, 매우 강한 치사율을 나타낸다. 쥐의 경우, 수 pg, 사람의 경우, 수 ng의 독소 주입이 치사를 나타낼 수 있으며 생화학 무기로 이용될 수 있다 [1]. 일반적으로 C. botulinum에 오염된 음식물을 섭취하면 체내로 유입돼 보튤리즘(botulism)을 유발하지만, 보툴리늄 신경독소가 이완성 마비(flaccid paralysis)를 유발하는 기능에 기반하여, 희석한 독소를 주름 개선 등의 미용 목적으로 이용하기도 한다. 일반적으로, 미국의 Allergan 주식회사의 “보톡스(Botox)”로 우리에게는 더 잘 알려져 있다. 최근에는 우울증이나 편두통, 과민성 방광, 당뇨에 기인한 실명 예방에도 보툴리늄 신경독소의 적용증이 확대되고 있다. 본 기고에서는 보톡스의 기본 작용 기전과 단백질 공학 측면에서의 최신 개발 동향에 대해서 간단히 소개하겠다.


보툴리늄 신경독소의 단백질 구조 및 작용 기전

보툴리늄 신경독소(이하 편의상 보톡스 또는 BoNT: botulinum neurotoxin)는 150 kDa의 분자량을 갖는 단백질 독소이다. 보톡스의 한 분자는 기능적인 측면에서 3개의 도메인으로 구분될 수 있는데, 단백질 분해효소(protease or light chain: LC), 세포질 전달 도메인(translocation domain, N-terminal heavy chain: HN), 수용체 결합 도메인(receptor binding domain, C-terminal heavy chain: HC)으로 구성된다 (그림 1). 보톡스가 작용하기 위해서는 표적인 신경세포(neuron)의 수용체에 먼저 결합해야 한다. 현재까지 밝혀진 보톡스 혈청형들은 뉴런의 막단백질인 synaptic vesicle 2 protein 또는 synaptotagmin에 특이적으로 결합한다고 알려져 있다. 추가적으로 뉴런의 막에 분포하는 ganglioside와 수용체 단백질의 당 moiety가 보톡스의 뉴런에 대한 특이적 결합을 증폭시킨다[2]. 최근에는 특정 혈청형의 보톡스에서 뉴런의 막 지질(lipid)과 직접적인 상호작용도 결합력을 향상시키는 것이 보고되었다 [3]. 뉴런에 특이적으로 결합한 보톡스는 내포작용(endocytosis)에 의해 뉴런 내부의 endosome으로 이동된 후, pH가 낮아짐에 따라 보톡스의 translocation 도메인의 특정 부위의 구조가 switch처럼 작용하여 protease 도메인을 endosome 외부 즉, 뉴런의 세포질로 이동시킨다. Translocation 과정 중 protease domain은 partial denaturation 되지만 세포질에서 chaperon에 의해 다시 refolding되며, 세포질의 환원력에 의해 disulfide bond로 translocation 도메인에 연결되어 있던 protease 도메인은 뉴런 세포질로 분리되게 된다.


그림1
그림 1. 보톡스 단백질 구조(PDB ID: 3BTA). 단백질 분해효소 도메인(protease, 파랑), 세포질 전달 도메인(translocational domain, 초록), 수용체 결합 도메인(receptor binding domain, 분홍)


Heavy chain과 분리된 protease 도메인은 신경전달물질의 전달에 관여하는 SNARE(soluble NSF (N-ethylmaleimide sensitive factor) attachment protein receptors)을 표적하여 vesicle fusion을 막는다. BoNT/A, C, E 혈청형의 경우 SNAP-25를 기질로, BoNT/B, D, F, G 혈청형은 VAMP protein을 기질로, BoNT/C는 syntaxin을 추가 기질로 하여 SNARE complex의 기능을 막는 것이 알려져 있다. SNARE complex가 보톡스에 의해 정상적인 신경전달을 못하게 되면, 이완성 마비(flaccid paralysis)가 유발된다. 파상풍 신경독소(tetanus neurotoxin)도 비슷한 작용 기전을 갖고 있지만 보톡스와는 다르게 강직성 마비(spastic paralysis)가 유도된다.


보톡스 단백질 엔지니어링

현재 의료 및 미용 목적으로 FDA에 승인된 보톡스는 혈청형 A1과 B1이 유일하다. 의료 및 미용 목적으로 A1이 주로 이용되며, A1 혈청형의 LC50가 kg 당 1ng이하라는 강력한 독성 때문에 의료 및 미용 목적으로 지속적으로 투여 받아도 단 기간 내에 면역되지 않는다. 다만, 장 기간 지속적으로 투여 받거나, 사고 등으로 일정 수준 이상의 보톡스에 노출될 경우, 면역 항체가 생성되어 더 이상 보톡스의 기대 효과를 볼 수 없거나 더 높은 수준의 투여량이 요구된다. 따라서 이와 같은 면역 등의 문제로 A1을 더 이상 사용할 수 없을 때에는 B1 등의 보톡스로 대체할 수 있지만 B1은 target receptor인 human synaptotagmin-II(Syt II)에 대한 결합 정도가 상대적으로 약하기 때문에 A1만큼의 강력한 효과를 기대하려면 60~100배의 단백질을 투여해야 한다. 그러나 더 많은 양의 단백질을 투여할 경우, 체내 비표적 조직 및 기관으로 확산되어 부작용을 유발하거나 면역을 더 촉진시키기 때문에 문제가 된다. 이를 해결하기 위해 Harvard Medical School의 Min Dong 교수 연구진은 B1 혈청형의 receptor binding domain을 saturation mutagenesis를 진행한 후 bacterial adenylate cyclase two-hybrid method를 이용하여 스크리닝하여 human Syt II에 결합 강도가 11배 향상된 E1191M/S1199Y 돌연변이를 개발하였다 [4]. 그리고 이 돌연변이를 이용할 경우, BoNT/A에 비해 B 혈청형이 더 효과적으로 알려져 있는 질병들인 침 뒤흘림(sialorrhea), 다한증(hyperhidrosis) 등에 이용될 수 있을 것을 기대된다. 실제로 preclinical 동물 model에서 E1191M/S1199Y가 도입된 돌연변이 BoNT/B1가 A1에 비교될 만한 강한 마비 효과를 보임이 증명되었다 [5].
수용체 결합 도메인에 대한 개량 연구가 결합도를 향상시키는 것에 주목한 반면, enzymatic domain (protease domain)에 대해서는 기질 특이성을 바꾸거나 체내 작용 기간을 조절하거나, 안정성을 향상시키는 방향으로 연구들이 진행되어 왔다. 대표적인 예로, Wisconsin 의대의 Joseph T. Barbieri 교수 연구진은 BoNT E1 혈청형의 기질 특이성을 SNAP25와 더불어 SNAP23까지 확장시킴으로써 천식이나 염증성 질환과 같은 hypersecretion 질병을 완화하는 의료용 보톡스를 개발했다 [6]. SNAP23는 비신경세포 단백질이나 BoNT/E1의 기존 기질인 SNAP25와의 구조 상동성이 높고, K224D 변이가 도입된 돌연변이 BoNT/E1의 SNAP25에 대한 기질 특이성 또한 유지되기 때문에 완전한 치료용 보톡스로는 한계점이 존재한다. 체내 작용 기간을 증가시킨 보고는 없지만 BoNT/A1의 C-terminus의 몇몇 잔기가 onset time 및 작용 기간을 조절한다는 사실에 기초하여 T420, F423, Y426, L429 잔기를 치환하여 야생형 대비 작용 기간이 짧지만 onset time은 빨라진 돌연변이를 개발한 사례도 보고되었다 [7]. 이러한 보톡스의 경우, 단기적인 신경 마비가 요구되는 근육 경련 또는 골절 등에 응용될 수 있다.
최근에는 보톡스가 기존 기질인 SNARE 단백질 이외의 단백질에 대한 기질 특이성을 갖도록 하는 돌연변이 개발 연구도 진행되었다. Broad institute의 David Liu 연구진과 Harvard Medical School의 Min Dong 교수 연구진은 Phage assisted continuous evolution 방법을 이용하여 본래 기질에 대한 특이성은 현저히 줄이고, PTEN (phosphatase and tensin homolog)에 대해 기질 특이성을 갖는 BoNT/E 돌연변이를 개발했다 [8]. PTEN이 신경 재생과 관련이 있는 단백질이기 때문에 이와 같은 새로운 보톡스의 개발이 여러 신경성 질환의 치료에 응용될 가능성을 제시했다고 볼 수 있다.
위에서 언급한 두 도메인들과는 달리 translocation domain의 경우 세포 내로의 translocation mechanism이 명확히 규명되지 않았기 때문에 엔지니어링 연구가 미미하다. 2013년에 독일의 Montecucco 및 Binz 그룹에서는 B1 혈청형의 보톡스 표면에 있는 E48, E653, D877 잔기를 각각 음 전하를 띄지 않는 amide로 치환했을 때 더 빠른 translocation에 의한 빠른 onset time 효과를 보고한 바 있다[9]. 2018년의 한 논문에서는 translocation의 initiation이 E620-F667 잔기 부위에 의해서 조절됨이 밝혀졌는데, physiological 조건에서는 해당 부위가 alpha-helices bundle이었다가 산성 조건에서 표면으로 노출되는 소수성 beta-hairpin구조를 가지면서 translocation domain의 channel 형성을 촉진한다는 기작이 제시되었다. 정확한 translocation 기작이 규명됨에 따라 switch helice와 같은 특정 부위의 서열 최적화를 통해서 translocation 효율의 극대화가 가능할 것으로 보인다[10].


키메라 보톡스

키메라 보톡스란 보톡스의 본래 도메인을 다른 보톡스의 도메인으로 치환하여 자연계에 존재하지 않는 새로운 돌연변이 보톡스를 개발하는 방법이다. BoNT/CD, BoNT/DC 및 BoNT/FA (H) 등과 같은 자연적으로 발생한 키메라도 있으며, 인위적으로 LC-Hn을 한 도메인으로 묶고, Hc를 다른 혈청형의 것으로 치환하여 키메라 보톡스를 제작하기도 한다. 이미 예전부터 키메라 보톡스 개발이 연구 목적으로 많이 시도되어 왔으며, 현재까지 개발된 키메라 보톡스는 E-A, A-B 등의 혈청형 등이 있다[11]. 키메라 보톡스의 경우, 각 혈청형 보톡스의 단점을 보완하면서 원하는 형질만을 추구할 수 있는 장점이 있다. 예를 들어, A-B chimera의 경우, BoNT/B의 다양한 뉴런 표적 형질을 유지한 채, BoNT/A의 상대적으로 긴 체내 유지기간 형질 또한 갖는 톡신을 만듦으로써 특정 질병 치료 등에 효과적인 치료제 후보로 개발되고 있다.


전달체로서의 보톡스

최근 들어 보톡스와 높은 상동성을 보이면서 박테리아 독소 단백질로 분류되는 단백질 중 새로운 혈청형들이 Min Dong 교수 연구진을 필두로 하여 여러 연구진에 의해 보고되고 있다. 대표적으로 BoNT/X [12], BoNT/En [13], CP1 [14], PMP1 [15] 등이 있다. 특히, 주목할 만한 점은 새로운 toxin 단백질들은 Clostridium 이외의 genus에서도 발견되고 있으며, 표적 숙주가 동물에 국한되지 않는다는 점이다. 대표적으로 PMP1의 경우, 모기나 파리와 같은 곤충에 특이적으로 결합하여 독성을 나타내는 것으로 알려졌다. 이와 같은 새로운 보톡스 유사 독소 단백질의 발견은 기존의 7개의 혈청형으로 국한되어 있었던 보톡스의 범주를 보다 확대시켰다.
최근 Min Dong 교수 팀은 BoNT/X의 불활성화 단백질이 기존의 전통적인 혈청형들과는 달리 세포 및 체내 독성을 보이지 않는다는 발견에 기초하여 불활성화된 BoNT/X를 특정 단백질의 전달체로 응용하는 연구를 수행, 발표하였다. 불활성 BoNT/X에 BoNT/A 또는 B를 억제하는 항체를 탑재하여 뉴런에 전달했을 때, 성공적으로 뉴런 내 BoNT/A 또는 B를 불활성화시킬 수 있었다[16]. 해당 연구는 세포 내 단백질에 대한 면역이 어렵다는 한계점을 극복한 연구로서 가치가 있는 발견이다. 이와 같은 신규 보톡스는 추후 다양한 신경 질병 관련 단백질을 표적하는 전달 매개체로서 응용될 수 있는 잠재력이 있다.


맺음말

지난 몇 년간 보톡스의 적용증이 미용 이외의 다양한 질병 범위로 확대되면서 여러 임상연구 및 특허 프로세스가 활발히 진행되고 있다. 국내에서도 보톡스를 개발 및 제품화에 성공하는 회사들이 많아지면서 보톡스에 대한 관심이 뜨겁다. 다만, 다양한 적용증에 대한 가장 최적화된 보톡스 개발은 아직 미진한 수준이다. 향후 의료계와 단백질 개량 연구계 간의 교류 및 협력을 바탕으로 해당 분야가 발전되어야 할 것이다. 또한, 보톡스의 새로운 기질 표적, 전달체로서의 기능을 이용하여 기존에 치료하기 어려웠던 신경퇴행성질환에 대한 효과적인 치료법도 개발되길 희망한다.



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  • 본 기고 글은 한민족과학기술자네트워크(KOSEN)의 해당 글을 바탕으로 개편 및 최신 연구 동향을 반영한 것이다. (https://doi.org/10.22800/kisti.kosenexpert.2019.251)