University of Illinois at Urbana-Champaign
이예지 박사E-mail : jjymlee@illinois.edu
지난 30여년간 기초 및 응용 미생물학 연구를 위한 주요 모델 미생물은 Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae 라 할 수 있다. 축적된 유전학적, 생리학적 정보를 쉽게 얻을 수 있기 때문에, 연구방법의 개발(최적배양조건 규명, 형질전환방법, 유전자 발현/파쇄 방법 등)보다는 대사경로와 유전자 조절기작 규명 등과 같은 연구를 보다 쉽게 수행할 수 있었다. 종래의 모델 미생물 중심 연구는 공통 생명현상의 이해 측면에서는 효율적이지만, 미생물의 다양성 및 산업화를 위한 연구에는 한계가 있다.
강아지의 경우에도 견종에 따라 생김새와 성격이 매우 상이하듯이, 효모의 경우에도 종류에 따라 그 발효 특성 및 생육 환경에 대한 저항성에 매우 큰 차이를 보인다 (그림 1). 그동안 효모 연구의 주류였던 S. cerevisiae (견종으로 비유하면 잘 따르고 매우 유순하여 쉽게 친해지고 다루기가 쉬운 골든 리트리버와 같은 효모이다)를 conventional yeast라 한다면, 최근에는 non-conventional yeast 에 대한 관심과 연구가 활발해지고 있다. 유지효모로 알려진 Yarrowia lipolytica와 Rhodosporidium toruloides (상당한 양의 지방을 축적하는 유전형질을 지닌 불독에 비유할 수 있을 것 같다), 단백질 분비 효모인 Pichia pastoris와 Hansenula polymorpha, 내열성 효모 Kluyveromyces marxianus, 내산성 효모 Issatchenkia orientalis와 Zygosaccharomyces bailii (극지방에 적응하여 살아가는 시베리안 허스키와도 같은 효모이다) 등이 대표적인 non-conventional yeast라 할 수 있다. 혐기 발효로 에탄올을 빠르게 생산하는 S. cerevisiae 와는 달리 non-conventional yeast는 에탄올이외의 다른 대사물질들을 호기적인 조건에서 생산하며 특히 생육조건의 상이한 특성으로 다양한 고부가 가치 물질을 생산하는데 conventional yeast 보다 유리한 점이 있다.
특히, I. orientalis 와 Z. bailii 효모의 경우는 매우 낮은 pH (<3)에서도 생장이 가능하기 때문에 유기산의 생산에 장점을 갖는 효모이다. 유기산 생산 공정의 낮은 pH는 암모니아 또는 탄산칼슘 등의 염기성 화합물로 조절하게 되는데, 그 과정중 생산된 유기산 화합물에서 다시 유기산을 회수하기 위한 강산 처리 공정이 필요하다. 그 때, 유기산과 동일한 양의 집섬(gypsum)이 생산되기 때문에 생산 비용뿐 아니라 환경 친화적 측면에서 불리한 치명적 단점을 극복하고자 내산성 효모를 활용한 유기산 생산 연구가 시작되었다.
I. orientalis 는 Pichia kudriavzevii 혹은 Candida krusei 등으로도 알려져 있으며 (Kurtzman et al., 2008), 위의 3종의 효모는 99.6%의 DNA 염기서열이 동일하다고 밝혀진바 있다 (Douglass et al., 2018). 우리나라에서는 전통주 제조에 사용되는 재래식 누룩, 김치, 식혜 등에서 분리되었으며 외국에서는 주로 와인이나 과일의 표피 등에서 분리/동정된 것으로 보고되고 있다. 내산성, 내당성 및 내알코올성이 우수한 효모로서 생육 온도는 20~40℃ 이며 식품의 발효 혹은 부패에도 관여하는 것으로 알려져 있다. 포도당, 과당, 설탕을 발효할 수 있으며, 비교적 광범위한 pH 조건에서 (pH 2-9)에서 생육할 수 있고, 특히 매우 낮은 pH(<2)환경에서 자랄 수 있다는 점이다. 최적 생육 조건인 pH 5.3대비 pH 2에서 88% 생장율을 보이고, 다양한 종류의 바이오매스를 황산 처리하여 얻어진 pH 2.5의 hemicellulose와 cellulosic oligosaccharides를 발효할 수 있다고 보고된 바 있다 (TATP, 2009). 이처럼 내산성과 더불어 내당성 (40% 포도당 발효) 및 내알코올성 (10% 에탄올 내성)도 우수하고, 5% sodium sulfate가 포함된 pH 2 환경에서 에탄올 생성능이 확인되기도 하였다.
Wild-type I. orientalis는 포도당, 과당, 설탕을 발효할 수 있지만, 갈락토스, 말토스, 락토스, 라피노스 등은 발효하지 못하는 것으로 알려져 있다. 대표적인 Crabtree-positive 효모인 S. cerevisiae는 포도당이 존재하면 호기적인 조건에서도 TCA-cycle 및 호흡대사에 관여하는 유전자가 발현되지 않아 유기산을 이용할 수 없는 특성을 보이는 것과 다르게, I. orientalis는 포도당 존재하에서도 유기산을 대사하는 Crabtree-negative 대사특성을 나타낸다. 그러나 세포 성장 중에 배지의 pH가 점점 감소하여 pH가 2-3까지 떨어진다는 특징을 보인다(그림2).
내산성 뿐만 아니라 다양한 발효 저해제에 대한 내성을 갖는 I. orientalis 균주는 유기산 생산의 플랫폼 균주로써의 잠재적 가능성이 연구되었다. 산과 염기가 고농도 함유된 배지에서 고온 조건(eg. 50g/L Na2SO4, pH 2.0, 43℃)에서 발효했을 때, 5.3%의 높은 에탄올 생성능을 보였다. 반면, 같은 조건에서 S. cerevisiae는 거의 성장하지 못하는 수준이었다 (Isono et al., 2012). 뿐만 아니라, US-DOE (US Department of Energy)가 선정한 활용가치 있는 화학물질 30종 중의 하나인 ᴅ-Xylonic acid를 고농도로 생산하는데 플래폼 균주로서 사용되었다. Caulobacter crescentus xylB 유전자가 도입된 I. orientalis 균주를 pH3.0 조건 하에서 146 g/L ᴅ-xylonic acid 를 생산하여, ᴅ-gluconic acid를 대체할 비식용 플랫폼 화학물질 생산 가능성이 입증된 것이다 (Toivari et al., 2013). US-DOE가 선정한 또다른 플랫폼 유기산인 succinic acid (Werpy & Petersen, 2004)의 생산경로를 I. orientalis에 도입한 연구에서, TCA-cycle reduction에 관련된 유전자의 발현을 증가시켜 11.6g/L succinic acid를 배지 pH조절없이 생산한 보고가 있다 (Xiao et al., 2014). 최근, 석유 기반의 플라스틱 생산을 지양하고 친환경 화학물질(green chemicals)을 기반으로한 poly-lactic acid(PLA)에 대한 요구가 급증함에 따라 lactic acid의 미생물기반 공정기술이 각광받고 있다. 기존의 lactic acid생산은 필연적으로 배지 내의 pH를 감소시키기 때문에 중화제를 과량 투입하여 발효를 유지시키고, 순수한 lactic acid를 얻기 위한 강산을 첨가하는 공정을 다시 거치게 되는 비효율적 방식이었다. 이러한 lactic acid 생산 공정에 유기산에 강한 내성을 보이는 I. orientalis를 도입함으로써 pH 중화제의 공급없이 산성 조건(pH3.6)에서 135 g/L lactic acid를 생산할 수 있는 균주가 개발되기도 하였다 (Park et al., 2018).
이처럼 강력한 내산성을 갖는 I. orientalis 균주는 바이오 연료 및 바이오 화학물질로 생산 호스트로서의 잠재적 가능성이 있지만, 섬유소 가수분해물에 다량 존재하는 자일로스를 대사하지 못하고 주된 발효 대사산물이 에탄올이라는 한계를 극복하기 위한 대사공학적 개량이 필수적이다. I. orientalis에 처음으로 외래유전자를 도입한 연구는, Aspergillus aculeatus 유래의 β-glucosidase를 발현시켜 동시당화발효 (Simultaneous saccharification and fermentation, SSF)를 가능하게 한 것이었다 (Kitagawa et al., 2010). 또한, S. cerevisiae 유래의 episomal 플라스미드를 도입해 xylonic acid 생산하였다 (Toivari et al., 2013). 이러한 연구 결과들과 앞서 소개한 lactic acid, succinic acid 생산하는 I. orientalis 균주 (Park et al., 2018; Xiao et al., 2014) 모두 FOA (5-Fluoroorotic Acid) selection으로 URA3가 파쇄된 영양요구성 돌연변이주를 만들고, 그를 이용하여 형질전환 균주를 제작하였지만 안정적인 플라스미드 발현 시스템이나 외래 유전자 발현 조절을 위한 promoter와 terminator의 정보가 매우 제한적이었다. 최근 I. orientalis 내에서 안정적인 플라스미드 복제를 위한 S. cerevisiae 유래의 autonomously replicating sequence (ARS) 를 사용하여 플라스미드를 제작하여 형질전환이 가능함이 보고되었다(Tran et al., 2019). 플라스미드의 안정성을 더욱 증가시키기 위하여 I. orientalis 유래의 centromere(CEN)을 탐색하고, RNA-seq분석, reporter 유전자의 발현 조사를 효율적인 promoter, terminator를 발굴하여 대사공학 연구를 가능하게 하는 보고가 있었다 (Cao et al., 2020). 나아가, in vivo assembly을 이용함으로써 일정한 homology를 갖는 DNA fragments를 세포 내에서 assembly하여 유전자 발현 플라스미드를 구축할 수 있게 되었고, Cas9 genome-editing tool을 적용하여 원하는 유전자의 파쇄와 외래 유전자의 발현 레벨도 조절할 수 있게 되었다(Cao et al., 2020). 하지만 여전히 I. orientalis의 영양요구성 돌연변이를 활용한 형질전환을 이용하기 때문에, URA3 유전자의 파쇄가 선행되어야 하기 다양한 환경에서 분리된 I. orientalis 균주들을 활용하는 데는 한계가 있을 수 있다.
최근에 발표된 Z. bailii 내산성 효모의 유전체 편집 기술처럼 (Kuanyshev et al., 2021), Kluyveromyces lactis 유래의 PAN-ARS(Autonomously Replicating Sequence)를 가진 플라스미드가 다양한 종류의 yeast에서 복제될 수 있다는 연구결과 (Liachko & Dunham, 2014)를 바탕으로 항생제를 기반으로 하는 플라스미드를 구축한 보고가 있었는데, 이 플라스미드가 I. orientalis 에도 적용될 수 있다면, Z. bailii의 유전체 편집 전략처럼 항생제 유전자를 이용한 유전자 조작 및 유전체 편집이 가능할 것으로 사료된다.
합성 생물학의 발전과 더불어, Design-Build-Test-Learn (DBTL) 과정을 고속화하는 바이오파운드리를 활용하여 바이오매스 당화액으로부터 바이오연료 및 화학물질을 생산하기 위한 재조합 미생물 균주를 개발하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 바이오매스 당화액은 pH 가 낮고 다양한 fermentation inhibitor 들을 포함하고 있기 때문에, 척박한 배지환경에서 잘 자라는 I. orientalis의 생육 및 발효 특성을 활용하면 바이오 매스 당화액을 다양한 고부가 가치 물질로 전환하는 생물공정의 개발이 가능할 것으로 기대된다. 이를 위해서는 당면한 과제가 있다. 바이오매스 당화액에 고농도로 함유되어 있는 non-fermentable sugar인 xylose 와 유기산인 acetate 를 효과적으로 대사할 수 있도록 필요한 대사경로를 I. orientalis 에 도입하는 것이 필요하다. 나아가 I. orientalis 균주가 발효 중 배지의 pH를 낮추는 정확한 기작에 대한 연구가 이루어진다면 바이오매스 당화액을 이용한 바이오연료 및 화학물질 생산을 위한 플랫폼 균주로서의 가능성은 무한하다고 할 수 있겠다.
