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2020 December Vol.33 No.4 ISSN 1598-8384

자유기고

성봉현 박사
합성생물학을 위한 인공유전체 개발 연구동향

한국생명공학연구원
합성생물학전문연구단
성봉현 E-mail : bhsung@kribb.re.kr



서론

시작말

자연계에 존재하는 많은 생명체들은 저마다의 생존 환경에 따라 진화해 왔기에, 생명과학의 특징은 다양성과 복잡성이라고 언급될 정도로, 생명과학 연구자들은 예측불가능한 많은 문제에 직면하게 된다. 최근 생명공학 기술의 발전에 따라 유전체, 단백체, 대사체 등 방대한 생명체의 정보를 확보할 수 있게 되었지만 생명체의 다양성과 복잡성은 이러한 정보의 해석을 어렵게 한다. 최근 활발히 연구되는 빅데이터/인공지능 활용 기술을 통해 복잡함을 해결할 수도 있지만, 생명체를 가능한 단순하게 만들어, 즉 생명에 필수적인 유전자로만 이루어진 인공생명체 제작을 통해 극복할 수 있을 것이다. 이러한 목적으로 우리가 제어할 수 있고, 결과를 예측할 수 있으며, 실험 재현률이 높은 인공유전체를 제작하고자 하는 연구가 지난 20년 동안 이루어져 왔다. 인공유전체 합성의 첫 아이디어는 최소유전체에서 시작되었다. 이는 생명의 기원에 대한 연구에 활용될 수 있고, 대사효율이 극대화된 산업용 생명체를 제작하기 위한 뼈대 유전체(platform genome, chassis genome)로 활용될 수 있기 때문이다.



본론

최소유전체 제작법

최소유전체를 제작하기 위해서는 우선 생명체의 성장에 꼭 필요한 유전자들(minimal gene set)을 알아야 한다. 생존환경에 따라 필수유전자의 수가 달라지므로 (예를 들어 Burkholderia cenocepacia의 필수유전자 수가 LB 영양배지에서는 470개, M9 최소영양배지에서는 912개로 알려졌다[1]) 최소유전체라는 말이 무슨 의미가 있냐는 질문도 있다. 하지만, 일반적인 연구 환경 및 산업 환경은 자연환경만큼 다양하지 않기에, 특정 연구조건에서의 최소유전체 정보 습득을 위한 많은 연구가 수행되었다. 필수유전자 정보가 확보되면, 이를 활용하여 최소유전체를 디자인하고, 제작한다. 최소유전체 구축에는 크게 두 가지 방법이 제안되었다. 야생형(wild-type) 유전체에서 생존에 불필요하다고 알려진 (혹은 무작위로 선별한) 유전체 부위를 제거하는 하향식(Top-down) 접근법과, 최소유전체를 설계하고 짧은 DNA 조각을 연결하여 합성하는 상향식(Bottom-up) 접근법이다. 최근에는 이 둘을 접목한, 즉 큰 크기의 유전체 조각을 화학적으로 합성하고, 이를 유전체 부분과 치환하는 중간식(Middle-out) 접근법을 이용한 유전체 제작법이 활용되고 있다(그림 1).

그림1
<그림 1. 상향식, 하향식, 중간식 인공유전체 제작방법 [2] >


필수유전자 정보

최소유전체를 제작하기 위해서는 최소유전체에 대한 정보, 즉 생장 필수유전자들에 대한 정보를 파악해야 한다. 1995년 그람양성균인 Mycoplasma genitalium과 그람음성균인 Haemophilus influenzae의 유전체 염기서열이 밝혀진 이후, Mushegian과 Koonin은 이들 유전체에 공통적으로 존재하는 유전자가 생명현상 유지에 필수적인 유전자일 것이라고 추정하였다. 이들이 밝힌 생명필수 유전자의 기능은 DNA 복제, 재조합, 유전자 전사, 단백질 번역, 샤페론 단백질, 대사산물 수송, 핵산 대사에 관련한 것이었다. 이후 여러 종의 대장균 유전체 서열을 비교하여, 모든 대장균에 공통적으로 존재하는 2,996개의 유전자를 필수 유전자들이라고 추정한 연구도 있었다. 하지만, 유전체 비교분석을 통한 공통 필수 유전자 탐색법은 비교하는 이종생명체의 수가 많아질수록 공통된 유전자가 급격히 감소(약 100개의 유전체 비교 시 불과 63개의 유전자만 공통으로 존재)한다는 한계가 있다. 이는 같은 기능의 단백질들이 반드시 유사한 서열을 가지고 있지는 않기 때문이다. 이러한 한계를 넘어서기 위해 컴퓨터 모델링과 프로테오믹스를 통해 밝혀낸 대장균 핵심단백질을 분석하여 356개의 필수 유전자를 제시하기도 했다[3].


컴퓨터 분석에 이어, 유전자 넉아웃(knock-out) 및 제거와 같은 실험을 통해 필수유전자 정보를 확인하는 연구가 진행되었다. 이는 필수유전자가 아닌 생존 불필요 유전자를 탐색하는 방식이다. 첫번째로는 다량의 트랜스포존(transposon)을 유전체 내 임의의 위치에 삽입하고 배양한 뒤, 삽입위치를 확인함으로써, 불활성화 되어도 생존에 영향이 없는 유전자를 탐색하였다. 1999년, M. genitalium의 480개의 단백질 유전자(protein coding sequence) 중에서 실험실 성장조건에서 생존에 필수적인 265~350개의 유전자가 밝혀졌다. 같은 방식으로 Pseudomonas aeruginosa, H. influenzae, Corynebacterium glutamicumEscherichia coli의 트랜스포존 연구 결과 각각 678개, 670개, 658개, 620개의 필수 유전자가 확인되었다(표 1). 트랜스포존을 이용한 실험은 한번에 많은 비필수유전자 정보를 얻을 수 있지만, 삽입 위치에 따라 생존필수성 해석이 어렵고, 균주확보없이 정보만 얻을 수 있다는 단점이 있어, 실제 유전자를 하나씩 제거하는 연구도 진행되었다. 고초균(Bacillus subtilis)과 대장균의 유전자를 하나씩 제거하는 방법으로 각각 270개, 303개의 생장 필수 유전자가 밝혀졌다(표 1). 이 유전자들의 기능은 단백질 번역, 리보솜 구조, 세포 분열, 지질 대사, 전사 및 세포 외피합성 등에 관련한 것이었다.


이렇게 확보한 약 300여 개의 필수유전자가 모여있다고 생명체가 생존할 것이라고 생각하기는 어렵다. 왜냐하면, 합성치사(synthetic lethal)와 같이 하나의 기능을 하는 여러 유전자가 있을 경우, 한 번에 하나의 유전자는 제거가능하지만 모두 제거할 경우, 세포가 생장할 수 없기 때문이다. 또한 제거 시 성장이 급속히 나빠지는 준필수유전자도 존재하므로 실제 최소유전체를 제작하는 것은 보다 고차원적인 필수유전자 정보와 유전자 상호작용에 대한 이해가 필요하다.



표 1. 미생물 필수유전자수 예측[2]
표 1
방법 균주 필수유전자수/전체유전자수 (%) 참고문헌
유전체 서열 비교 M. genitalium and H. influenzae

COGs+NOGDa
256

63
[4]

[5]
유전체 전위
(Global transposition)
M. genitalium

M. mycoides

H. influenzae
RD

E. coli K12

P. aeruginosa

H. pylori

C. glutamicum
R
265–350/468 (79%)

473/901 (52.5%)b

670/1703 (38%)

620/4296 (14%)

678/5500 (12%)

255/1590 (16%)

658/2990 (22%)
[6]

[7]

[8]

[9]

[10]

[11]

[12]
단일 유전자 제거 S. cerevisiae

B. subtilis
168

S. typhimurium LT2

E. coli K12
1105/5916 (19%)

271/4099 (6.8%)

490/4597 (11%)

303/4296 (7%)
[13]

[14]

[15]

[16]

aCOG, clusters of orthologous groups of proteins; NOGD, non-orthologous gene replacement

b건강한 세포성장을 위한 233개의 준필수유전자(quasi-essential genes) 포함



하향식 유전체 축소

하향식 최소유전체 제작법은 유전체의 불필요한 부위를 하나씩 제거해 나가는 방법으로, 유전체 정보가 불완전하더라도 제거과정에서 성장 확인이 쉽고, 반복적 시도를 통해 실현 가능성이 높다는 장점이 있다. 미생물 축소유전체(reduced genome) 제작은 2000년 대 초반부터 대장균에서 시작되었다. 여기서 축소유전체라고 언급하는 이유는 최소유전체를 제작하는 과정에서 만들어진 유전체들이 발표되었기 때문이다. 이후에는 고초균, C. glutamicum, P. putida, 방선균(Streptomyces) 및 효모(yeast)의 축소유전체도 제작되었다(표 2). 대장균 유전체 축소는 상동재조합(homologous recombination), 위치특이적 재조합(site-specific recombination), P1 transduction 등의 반복적 사용을 통하여 이루어졌다[17]. 무작위로 정한 불필요유전체 부위를 제거하여 유전체의 30% 이상이 축소된 균주가 제작되거나, 유전체 불안정 요소인 반복서열, 박테리오파지 잔여물, insertion sequence 등이 제거되어 유전체 안정성이 증가된 축소유전체 대장균도 제작되었다(그림2)[18]. 고초균에서 모든 파지 잔여물(prophage) 등 0.99 Mb의 유전체가 축소된 유전체 MG1M이 구축되었으며, 중요 아미노산 및 유기산 생산균주인 C. glutamicum의 경우 Cre/loxP 재조합 시스템을 통해 유전체의 11.9%가 제거되었다. 효모 Schizosaccaromyces pombeSaccharomyces cerevisiae 유전체에서는 각각 500 kb 이상 제거되었으며, 항생제 및 2차 대사물 생산 방선균 Streptomyces almitilis 에서도 유전체의 18.5% (1.67Mb)가 축소되었다.

그림2
<그림 2. 축소유전체 대장균들의 모균주 및 축소 비율[19]>


유전체 축소 대장균 MGF-01은 트레오닌 생산을 위한 유전 회로를 도입했을 때, 야생형보다 두 배 높은 생산성을 보였다. 유전체 불안정성 증가요인을 제거한 MDS42와 MS56는 야생형보다 자연돌연변이 발생률이 2배 이상 낮았다. 고초균 축소유전체 균주인 MGB874는 야생형 균주보다 셀룰로오스 및 단백질 분해효소를 각각 1.7배와 2.5배 더 많이 생산했다. 축소유전체 효모는 높은 에탄올(1.8배)과 글리세롤(2배) 생산성을 보였으며, 방선균 SUKA17에서는 항생제인 스트렙토마이신과 세파미신 생산성이 증가했다(표 2). 현재까지 제작된 많은 축소유전체 균주들이 생산성이 수십배 증가할 것이라는 기대만큼 큰 효과를 보이지는 않았다. 이는 지금까지 하향식으로 제작된 유전체가 체계적으로 제작되지 않았기 때문일 수도 있다. 생명현상에 대한 이해가 더 높아져 보다 정밀하게 설계된 최소유전체를 제작하면 세포 내 에너지 사용효율이 높은 생명공학용 chassis로 사용될 수 있을 것이다.


상향식 유전체 합성

상향식 접근법(bottom-up approach)은 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)를 합성하고 연결하여 인공적으로 유전체를 합성하는 방식이다. 이는 최소 유전체에 대한 완전한 정보가 필요함과 동시에 큰 유전체를 오류 없이 조립하여 세포에 도입해야 하기 때문에 기술적으로 많은 어려움이 존재한다. 기술이 발달하면서 상향식 접근법이 점점 가능하게 되었다. 초기에는 새로운 유전체를 제작하기보다는 기존에 존재하는 유전체를 화학적으로 합성할 수 있음을 보여주는 연구가 많았다. 이를 통해 소아마비 바이러스(poliovirus), 박테리오파지, 천연두 바이러스(smallpox virus), 1918 스페인 독감 바이러스를 복제하는 연구가 진행되었다. 인공유전체 세균을 제작하는 연구는 미국 J. Craig Venter Institute(JCVI) 주도로 이루어졌다. Mycoplasma 유전체를 화학적으로 합성하고, 이식하여 인공유전체를 합성하였고[20], 이러한 기술을 확장시켜, 쥐의 미토콘드리아도 합성하였다[21].


그리고 1 Mb 크기의 M. mcoides 유전체를 기반으로 531kb의 최소유전체 JCVI syn3.0을 합성하였다[7]. 처음에는 트랜스포존을 이용하여 필수유전자를 선정하고, 이를 바탕으로 최소유전체를 디자인했지만, 제작에 실패했다. 그래서 생장 조건에서 반드시 필수적인 유전자들은 아니지만, 제거 시 세포성장이 감소하는 준필수유전자들을 추가하여 인공 세포를 제작하는데 성공할 수 있었다(그림 3). 앞서 언급한 바와 같이 단일유전자 수준에서 확보한 필수유전자 정보만으로는 최소유전체를 제작할 수 없음을 확인한 것이다.


다른 최소유전체는 수생 비병원성 세균인 Caulobacter crescentus의 유전체 정보를 바탕으로 제작되었다[22]. 스위스 취리히 연방 공과대학교의 Beat Christen 박사 연구팀은 초고밀 트랜스포존 삽입을 통하여 필수유전자 정보를 확인하고, 이를 바탕으로 연구팀에서 개발한 컴퓨터 알고리즘을 활용하여 중복되는 염기서열을 제거, 676개 유전자를 지닌 785.7 kb의 C. eth-2.0을 제작하였다. JCVI에서 제작한 Mycoplasma가 병원성의 기생미생물임에 반해 Caulobacter는 독립성장이 가능한 미생물이어서 최소유전체의 크기와 기능이 차이가 있다.

그림3
<그림 3. 최소유전체의 설계 및 합성. (a) 인공유전체 합성방법 모식도, (b) Mycoplasma 최소유전체, (c) Caulobacter 최소유전체 제작[7, 22]>


최소유전체를 제작하고자하는 노력은 새로운 인공유전체의 합성으로 확장되었다. 최소유전체가 기초과학 측면에서 생명체의 근간을 위한 연구라면, 생명공학적 측면에서 활용가능한 인공유전체도 개발되었다. 신기능 인공단백질 개발을 위하여 단백질에 비천연아미노산을 도입하는 연구를 많이 하는데, 일반적으로는 amber suppressor 기능을 이용하여 종결코돈(stop codon) TAG에 비천연아미노산을 도입한다. 하지만 대장균에는 321군데의 TAG 코돈이 존재하므로, 원하는 단백질 이외에 321개 유전자에 변이가 생기는 문제가 발생한다. 이를 해결하기 위해서 모든 TAG 코돈을 TAA 코돈으로 바꾼 대장균이 제작되었고, 이를 확장하여 64개 코돈 중 7개를 제거한 대장균이 개발되었다[23]. 이 경우 62,214곳의 변이가 필요하기 때문에 상향식 유전체 합성 방법이 적용되었다.


미생물 인공유전체 합성에 맞춰, 인간 유전체 서열을 합성하기 위한 Human Genome Project–Write (HGP-write)를 논의하기 위해 모임이 있었다[24]. 이는 윤리적 측면에서 많은 반발을 불러일으켰고, 지금은 질병에 대한 내성이 있는 식물의 유전체를 합성하는 쪽으로 한발 물러선 상태이다. 하지만 드러나지는 않았지만 지금 어딘가에서 연구가 이뤄지고 있을지도 모른다. 새로운 생명체를 제작한다는 것은 우리가 신의 영역에 도전하는 것이라, 연구와 윤리 사이에서 많은 고민이 필요할 것이다.



중간식 유전체 제작

현재 기술로 유전체 DNA는 제작가능하나, 유전체를 포함하는 세포질은 제작하기 어려워, 합성한 유전체를 자연계에 존재하는 세포 내로 이식하고 증식한다[20]. 최근에는 유전체 이식 문제의 단점을 극복하기 위하여, 유전체의 일부를 합성유전체 조각으로 단계적으로 치환하여 인공유전체를 제작하는 중간식 접근법의 연구가 진행되고 있다(그림 4).

그림4
<그림 4. 중간식 인공유전체 합성 (a) 효모 유전체 합성과 재배열, (b) 연속적 유전체 치환을 통한 대장균 유전체 합성 >


미국 보에크 교수 연구진은 2007년부터 '효모유전체 합성 프로젝트(Sc2.0)'를 국제 컨소시엄으로 진행하고 있다. 효모 S. cerevisiae 유전체를 새로 합성하면서, 유전체 구조와 진화 연구를 위해 위치특이적 재조합 loxP 서열을 유전자 사이에 도입하였다. 전체 16개의 유전체 중 5개를 합성하여 보고하였고[25], Cre 단백질을 발현하여 유전체를 무작위로 재배열하고 에탄올 생산성이 향상된 균주를 선별한 뒤, 유전체를 분석하였다[26]. 영국 캠브리지 대학에서는 하향식 방식으로 제작된 축소유전체 MDS42 균주 정보를 바탕으로 amber codon(TAG)이 제거된 대장균 인공유전체를 중간식 접근법으로 합성하였다[27]. 이처럼 DNA 합성을 통해 화학적으로 완전히 새로운 유전체를 만들어서 원하는 목적에 맞는 기능을 가지는 미생물을 만들수 있는 기술은 어느정도 갖춰지고 있다. 앞으로는 어떤 목적의 유전체를 설계하느냐가 더 중요해 질 수 있을 것이다.



표 2. 제작된 축소/최소 유전체의 크기 및 특징[2]
표 2
균주 제거/합성 크기 특징 참고문헌
E. coli MDS42 0.7 Mb(15%) 제거 유전체 안정성 및 형질전환효율 향상 [18]
E. coli MGF-01 1.03 Mb(22%) 제거 아미노산 트레오닌 생산 2배 증가 [28]
B. subtilis MGB874 0.87 Mb(20.7%) 제거 Extracellulase(1.7배), protease (2.5배) 생산증가 [29]
Streptomyces avermitilis SUKA17 1.67 Mb(18.5%) 제거 항생제 생산성 향상 [30]
Saccharomyces cerevisiae MFT1160 531.5 kb(5%) 제거 에탄올(1.8배) 및 글리세롤(2배) 생산성 향상 [31]
JCVI-syn3.0 531.5 kb 합성 화학적으로 합성된 최소유전체 [7]
C. eth-2.0 785.7 kb 합성 C. crescentus 필수 유전자 분석, 화학합성 [22]
E. coli Syn61 3,978.9 kb 합성 축소유전체 대장균 MDS42 기반, 코돈3개 제거 유전체 화학합성 [27]

맺음말

국내에서는 한국과학기술원 생명과학과 김선창 교수 연구진이 대장균 최소유전체를 제작하기 위한 유전체 재조합 기술을 개발하고, 이를 바탕으로 유전체의 약 30%(약 1Mb)가 제거된 대장균을 제작하였다[32, 33]. 같은 과의 조병관 교수는 이렇게 제작된 유전체의 인공진화를 통한 기능개선 연구를 최근 보고하였다[34]. 국내에서는 아직 상향식 유전체 합성에 대한 연구는 이뤄지지 않았지만 최근 한국생명공학연구원을 비롯한 몇몇 대학에서 시도되고 있다.

인공유전체의 제작은 많은 시간과 비용이 소요되므로 쉽게 접근할 수 있는 연구분야가 아니다. 특히 상향식 유전체 합성의 경우, 오랜 노력으로 제작한 생명체가 생장하지 못하면 아무것도 남지 않는 상황을 맞이할 수도 있어, 현재는 제작한 인공유전체 그 자체가 결과가 될 수 있는 연구가 이뤄지고 있다. 그래서 성장 필수 유전자들로만 구성된 최소유전체, 인공단백질 생산을 위한 특정코돈 제거 유전체 제작이 주를 이루고 있다. 앞으로는 빅데이터와 인공지능 기술이 덧붙여져 단백질 생산 향상 또는 유용물질 생산 증대을 위한 인공유전체 제작이 가능해 지지 않을까 한다.


필수 유전자들의 이해에서 산업적인 응용까지, 많은 연구자들은 최소유전체를 만들기 위해 필수적인 유전자들을 식별하였고, 유전체 조각들을 편집하고 재조합하는 기술을 개발하였으며, 최근에는 유전체의 화학적 합성을 통하여 최소 유전체를 구축하였다. 최소 유전체 중 일부는 유전체 안정성이 향상되거나 합성 물질의 생산량이 증가하는 등, 일반 생명체에 비해 우수한 결과를 보여주었다. 지금까지 20여 년간 최소/인공 유전체를 구축하기 위한 연구가 계속되어 왔으며, 향후 연구자들은 과학적인 기초 연구뿐 만 아니라 산업적인 목적에도 가장 이상적인 인공유전체를 구축할 것이다. 이러한 인공유전체 연구는 복잡한 유전체 및 생명체의 진화에 대한 이해, 대사회로의 재구성, 맞춤형 미생물 구축 등에 대한 통찰력을 제공할 수 있을 것이다. 합성생물학이 생명공학 혁신의 도구로 인식되는 상황에서 최근 관심이 증대되고 있는 바이오파운드리를 활용한 맞춤형 유전체 구축은, 유용한 의약품 및 화학소재 생산 또는 환경보호 연구를 가속화할 수 있을 것이다.



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